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蜂毒肽的基因工程

分类:蜂产品 作者:蜂蜜百科常识 评论:0 点击: 310 次

生物工程技术的发展为获得蜂毒肽提供了一条新的途径, 对其进行的分子生物学研究是用生物工程技术对蜂毒肽改造利用的基础。

.jpg - 蜂毒肽的基因工程

Kindas 等从处女蜜蜂蜂王的毒腺中提取得到了总mRNA, 并证实其所提取得到的蜂王毒腺总 mRNA 中 80 %是蜂毒肽 mRNA, 发现蜂毒肽 mRNA 含大约 400 个碱基对和 1 个短的 polyA 结尾。Lane 等将从蜜蜂毒腺提取得到的RNA 注射到非洲蟾蜍的卵母细胞中, 并在其中进行了表达, 证明非洲蟾蜍的卵母细胞不能对蜂毒肽前体蛋白进行修饰。Vlasak 等用 mRNA※DNA 逆转录的方法, 利用质粒 pBR322 构建了蜂王毒腺的 cDNA 文库, 用蜂王毒腺总 mRNA 制作探针从此文库中分离得到了蜂毒肽的 cDNA, 再进一步将其克隆到质粒 pUC18 上进行 DNA 序列分析, 由 DNA 的序列分析结果推测出的蜂毒肽序列与实际测得的完全相同。1991 年张青文用 Kindas 的方法提取了蜂王毒腺的 RNA 用于在棉铃虫卵中的转译, 并对提取的 mRNA 成分进行了研究, 结果发现总 RNA 在除去 rRNA 后就可得到高纯度的蜂毒肽mRNA。1997 年李继周等 用 lgt11 建立了蜂毒肽的 cDNA 文库, 并用抗体探针筛选出了阳性克隆。1998 年陈仲兵等进一步将蜂毒肽 cDNA 克隆到大肠杆菌质粒 pUC18上, 并进行了序列分析。

蜂毒肽具有破坏细胞膜、致死细胞的特性, 因此要从原核和真核表达系统获得有活性的蜂毒肽, 需要以融合蛋白形式表达。He 等报道以融合蛋白在 E。coli 中表达 prepromelittin。融合蛋白的 N-末端是 β-半乳糖苷酶(β-galac-tosidase
), C-末端是 prepromelittin, 在 10 mmol MgCl 2 或质量分数为 0。083(8。3 %)的乙醇, 信号肽酶抑制剂的诱导培养基上,可产生全长融合蛋白(β-gal -pM)。带有信号肽的可溶重组蛋白, N-端 660个氨基酸残基能够被 E。coli 内膜易位结构和前导肽识别。在可诱导的启动子控制下, 将编码 prepromelittin 的cDNA 连接在 Protein A 或β-半乳糖苷酶基因的 3′末端, 2个蛋白连接处是编码 Factor Xa 的寡核苷酸。Protein A 融合表达量较高, 大约80%形成包含体, 其融合的 prepromelittin引起一些完整的融合蛋白释放到培养基中;Prepromelittin 与β-Gal 融合时表达量低, 而且附着在 E。coli 的细胞质膜上,它的表达对 E。coli 是有毒性的 。1996 年 Dunn 等 将蜂毒肽基因和来自于鼠抗人骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞表面特异蛋白的抗体 scFv 基因相融合, 构建了可以杀死肿瘤细胞的抗毒素基因, 并且实现了融合基因在大肠杆菌中的表达, 精制后的抗毒素在体外显示了杀死肿瘤细胞活性。笔者多年来也做了一些工作。我们从蜜蜂毒腺中提取总 RNA, 通过 RT-PCR 方法扩增得到了 prepromelittin的 cDNA, 再进一步通过定点诱变, 在 melittin 的序列前引入羟胺裂解位点, 构建了与β-半乳糖苷酶部分序列相融合 melittin 诱变蛋白表达载体, 并在 E。coli 中表达了诱变蛋白 。




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